有机磷杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶抑制作用的测定
发布时间: 2011-06-12   浏览次数: 3722

有机磷杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶

抑制作用的测定

指导教师姓名:熊忠华(博士)

 

1. 目的要求

通过本实验了解有机磷杀虫剂对昆虫神经系统乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。由于乙酰胆碱累积,神经受过度刺激,胆碱能系统破坏(或受阻),而引致昆虫中毒以至死亡。

本实验采用酶化学比色法测定受药剂处理后中毒昆虫酶被抑制程度。此原理也可应用于对农产品中有机磷杀虫剂残留量分析和有机磷中毒病人血液中的胆碱酯酶活性的测定。

2. 原理

正常状态昆虫在受到外来化学物质的刺激下,产生神经冲动,该冲动沿神经细胞的轴突迅速传递至突触前膜时,冲动即消灭,但它却刺激突触前膜释放出乙酰胆碱,与突触后膜的乙酰胆碱受体结合,使冲动传递继续进行,随后,乙酰胆碱立刻被乙酰胆碱酯酶所分解。\

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当有机磷杀虫剂与乙酰胆碱酯酶互相作用时,乙酰胆碱酯酶被抑制。

 

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由于酶被抑制,不能水解乙酰胆碱,昆虫体内乙酰胆碱累积,从而致使中毒。

本法以有机磷处理昆虫后,取昆虫头部研磨成匀浆液作酶源,与定量的乙酰胆碱在一定条件下,经该酶水解后剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用生成异羟肟酸,再与三氯化铁作用生成羟肟酸铁络化合物(红棕色)。用分光光度计测定其光密度值。如酶被抑制高时,剩余的乙酰胆碱多,光密度值大,反之,则光密度小。

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3. 实验材料

3.1  试剂

磷酸盐缓冲液  称取纯结晶磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 16.72g及磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.72g,以重蒸馏水溶解并注入到1000ml容量瓶中,pH7.2

0.004M溴化乙酰胆碱溶液  准确称取溴化乙酰胆碱[CH3COO·CHCH2N(CH3)3]Br 0.1809g,以磷酸盐缓冲液溶解并注入到200ml容量瓶中,加磷酸盐缓冲液至刻度。

2M盐酸羟胺溶液  称取盐酸羟胺(NH2OH·HCl)13.9g溶于100ml重蒸馏水中。

上述三种试剂配制后均存入冰箱中备用。

④ 3.5N氢氧化钠(NaOH)溶液  称取氢氧化钠(NaOH)14g溶于100ml蒸馏水中。

⑤ 12盐酸溶液  用化学纯盐酸(HCl)1份加蒸馏水2份。

0.37M三氯化铁溶液  称化学纯FeCl3·6H2O l00g溶于0.1NHCl溶液中,最后定容至1000ml

0.1NHCl溶液配制:吸取3.09ml化学纯HCl1000ml容量瓶中,后加蒸馏水至刻度。

3.2  实验用具

玻璃匀浆器、搅拌机、小剪刀、水浴控温摇床(或恒温水浴箱)、玻璃丝、10ml试管、721分光光度计、0.51.02.0ml吸液管等。

3.3  酶的制备

5%敌敌畏丙酮液在每头昆虫的胸背板处点滴2/A(供试昆虫可用粘虫、棉铃虫、玉米螟等高龄幼虫或荔枝蝽象),处理后约经30—60分钟,当昆虫中毒并接近死亡时,立即用小剪刀剪下20头昆虫头部盛于玻璃匀浆器内(预先吸入约3ml冰冷的磷酸盐缓冲液),在低温条件下进行匀浆,以少量玻璃丝置于小型漏斗上把虫浆过滤,滤液用磷酸盐缓冲液定容至5ml,暂贮于冷冻室内备用。

另取20头正常(无药处理)昆虫头部,匀浆处理与上述药剂处理组相同。

4. 标准曲线的制作

取试管12支,分为6(每组2),用吸管分别注入0.20.40.60.81.01.0ml的试剂于各组已作标记试管中,并分别加入试剂至试管中,使各管的溶液总量为1.5ml。然后将1—5组试管分别加入2ml试剂混合液(1 1比例临时混合),用力摇动1分钟,加入lml试剂摇匀,加入lml试剂,摇匀后呈现深浅不同颜色。第6组试管在加入试剂至总量达1.5ml后,先加入试剂⑤lml,摇匀后加入2ml试剂混合液(11比例临时混合),摇匀后加lml试剂,摇匀即成空白管。

5. 样本分析

取洁净干燥的试管9支,编号为1(1)1(2)(指正常B)2(1)2(2)  (指正常虫对照管)3(1)3(2)(药剂处理管)4(1)4(2)(药剂处理对照管)5(空白管)。于各试管中加入lml试剂13管各加0.5ml正常虫和药剂处理后的虫浆,5号管则加入0.5ml磷酸盐缓冲液,摇匀后置于预先调好为37℃的恒温水浴摇床里40分钟。除空白管外,

1  标准曲线操作步骤

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其它各管应立即加入2ml试剂混合液(ll比例临时混合),用力摇动1分钟以上,24对照管分别加入正常虫和药剂处理虫的虫浆液各0.5ml。摇匀后加试剂⑤lml,摇匀后再加试剂⑥lml,摇匀后用滤纸过滤,空白管的制作同标准曲线中的空白管制作相同。其操作步骤也可见表12

2  样本制作步骤

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6. 测定和结果整理

把标准或样本按制作步骤完成后,将滤液分别移至各比色杯中,用分光光度计在波长540μm下进行测定。以空白管调节光密度为“0”,分别测定标准或样本管并读出它们的光密度数值。

以不同浓度的乙酰胆碱量(微克分子浓度,/μM)数值做横坐标,各管测得的光密度数值做纵坐标即可绘制成一标准曲线。把测定样本的光密度值可从标准曲线坐标上求出样本的乙酰胆碱量。从而代入公式,求乙酰胆碱酯酶被抑制百分率()。例如,粘虫幼虫经敌敌畏处理后,其头部乙酰胆碱酯酶活性及其抑制百分率(),见表3

3  敌敌畏处理粘虫幼虫后乙酰胆碱酯酶活性及被抑制率()

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受药后5龄粘虫幼虫(头部)乙酰胆碱酯酶被抑制率(%):

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7. 习题

1. 按表18—1标准曲线制作方法绘制一标准曲线图,并按表18—3填写试验结果和作分析。

2. 采用酶化学法应特别注意哪些条件。