南丰蜜桔黑星病拮抗内生细菌的筛选

指导教师姓名：向妙莲（博士）

1．研究目的

南丰蜜桔黑斑病系南丰蜜桔重要病害，对其产量和品质造成极大影响，严重阻碍了南丰蜜桔出口欧盟等高等市场。为解决传统化学防治中病菌抗药性和农药残留等问题，利用内生细菌控制南丰蜜桔黑斑病为该病害的防治提供了新的思路。

2．实验方法和技术线路

2.1 实验方法

2.1.1内生细菌的分离和鉴定

将无菌处理的柑橘茎、叶、果样品各3 g，加10 mL无菌水碾碎；静置15 min后，用无菌移液枪取70mL，涂在牛肉蛋白胨培养基平板上，28℃培养3-5 d，长出菌株。根据菌株的形态、遗传特性和分子生物措施，确定菌株的属种。

2.1.2 内生细菌的纯化

待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的细菌接于新的牛肉膏蛋白胨培养基进行划线分离培养。培养数日后，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应的记录。对菌株编号后，转至新鲜箱斜面培养基上，于28℃培养箱中培养5～7 d，然后放入4℃冰箱保存。

2.1.3 内生细菌的筛选

采用浇混平板法。用PDA液体培养基28℃下振荡培养12 h，发酵液10 000 r／min离心10 min，取上清液，重复3次。将1.5 mL滤液和15 mL PDA培养基于60℃左右混合均匀倒入培养皿，冷却凝固后，在每个培养皿中接入直径为6 mm 的黑斑病菌菌块，28℃下培养4 d。以直接培养的病原菌作为对照。

2.1.4 内生细菌对柑橘黑斑病菌的拮抗作用

PSA培养基平板中接上已活化的供试菌饼，在供试菌周围接上沾有内生细菌直径为5 mm的纸片，将培养皿倒放在28℃培养箱中培养， 每个菌在不同培养皿中设3个重复，5d后观察抑菌效果，测量抑菌圈宽度。

3．试剂、材料计划清单

4．实验动植物计划

5．设备、器材（要求准确、完整，少量购置需注明供应商和价格）