江西农业大学植物生产实验教学示范中心

研究创新型实验教学计划书

柑橘砧木资源耐酸性评价及耐性机制研究

指导教师姓名：  徐小彪  职称/学位：  教授/博士  

1.  实验项目名称

柑橘砧木资源耐酸性评价及耐性机制研究。

2.  研究目的

以15份柑橘砧木资源为试材，采用不同酸度（pH2.5~6.5）营养液处理的方法，研究根际不同pH值对柑橘砧木生长、形态、生物量和生理指标（包括可溶性蛋白质含量、脯氨酸Pro和丙二醛MDA含量、羟自由基含量、相对膜透性RMP、超氧化物歧化酶SOD和过氧化物酶POD活性、过氧化氢酶CAT活性和光合色素含量等）的影响。应用抗逆系数ARC结合低pH胁迫试验以及聚类分析对柑橘砧木耐酸性强弱进行综合评价。进一步分析各项生理指标与所测数据，进行相关性、隶属函数等数理统计分析，力图找到各项生理指标在不同pH梯度下的变化规律，以及各项生理指标间的相关性及其与柑橘砧木耐酸性的关系，分析柑橘砧木耐酸性差异的生理生化基础，揭示不同耐酸性柑橘砧木适应酸性逆境差异的可能机制，可为柑橘砧木的分子育种与遗传改良提供理论依据，为筛选出具有较强耐酸性的新型柑橘砧木奠定基础，对于柑橘砧木种质资源的合理开发与利用具有重要的现实意义。

3.  实验方法和技术路线

3.1  试验材料与处理

供试材料为枳壳、枳橙、酸橙、酸柚、红橘等15份柑橘砧木种子。将经过高温消毒的基质装入直径为30 cm、高15 cm的塑料盆中备用。播种前种子用温水浸泡5 h后置于光照培养箱中，待60%种子露白后点播于塑料盆中，每盆10~20粒。在光照箱中培养出苗，于4叶期向塑料盆中加入等量不同pH值的营养液进行酸性处理，其pH值分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0（营养液pH值的调节采用广用缓冲液体系,用NaOH调整至设定的pH值，采用S-3C 型精密酸度计进行pH值测定）。对照（Control）为pH 6.5的营养液（柑橘生长与发育的最适酸度）。处理时先用缓冲液冲洗基质1次,再喷入相应pH值的营养液,直至育苗盘底部流出的营养液pH值达到设计要求为止。以后每隔3 d浇1次设计pH值的营养液，其余时间视水分情况补充水分。采用随机区组设计，单株小区，每处理重复三次。培养30d后进行各项生理指标的测定。生理指标测定参照《植物生理生化实验原理和技术》。测定时选择中部外侧第2~3片功能叶为测试材料，各项指标重复三次。

3.2  测定指标及方法

① 耐酸性评价

试验处理期间每2d调查1次受害情况，处理结束后统计受害株率、受害等级、受害症状开始出现的时间、死亡时间、出现受害症状及死亡时间的个体间差异，计算受害指数，根据抗性标准对供试材料的耐酸性进行分析与评价。

根据受害症状轻重将酸害分为6 级：0 级（无明显受害症状）；1 级（叶尖或叶缘黄化）；2 级（叶尖或叶缘水渍状或褐化）；3 级（植株上有一叶片整叶褐化或干枯）；4 级（多数叶片整叶褐化或干枯，嫩梢或部分苗茎褐化) ；5 级（苗茎或整株死亡）。

根据受害指数将抗酸性分为5 级：极强（受害指数0.0%～20.0%）；强（受害指数20.1%～40.0%）；中等（受害指数40.1%～60.0%）；弱（受害指数60.1%～80.0%）；极弱（受害指数80.0%～100.0%）。

受害指数(%) = Σ(受害级值×同级株数)/(最高级值×总株数)×100

抗逆系数（adversity resistance coefficient，ARC）=胁迫指标性状值/对照指标性状值。

生理指标胁迫变化幅度（%）=（胁迫15 d 时的各生理指标测量值－对照的各生理指标测量值）/对照的各生理指标测量值×100%。

② 相对含水量测定：采用称重法测定叶片相对含水量。取植株迅速称量其鲜重，然后置于105摄氏度下烘15~20min，再于80摄氏度下烘至恒重，干燥半小时后称干重，根据组织含水量（%）=（鲜重-干重）/鲜重×100计算出含水量。

③ 根系中可溶性蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝G-250法。

④ 丙二醛(MDA) 含量测定：取0.5克叶片，加5%TCA5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min；取上清液2ml，加0.67%TBA2ml，混合后在100摄氏度上煮沸30min，冷却后再离心一次；分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。应用如下公式计算MDA 含量。

MDA含量 (μmol/g) = MDA浓度 (μmol/g)×提取液体积 (mL) / (样品重量(g)×1000)

⑤ 脯氨酸(Pro)含量测定：采用酸性茚三酮法。

Pro含量（μg/g）＝（X×5/2）/样重（g）。

⑥ 超氧化物歧化酶(SOD)测定：采用氮蓝四唑（NBT）法。

⑦ 过氧化物酶(POD)活性测定：采用愈创木酚法。

⑧ 过氧化氢酶(CAT)活性测定：采用紫外吸收法。

3.3  数据统计与分析

对所测各生理指标采用Duncan新复极差法进行统计分析，并运用SPSS软件及Excel进行相关性分析及图表制作与隶属函数计算。

3.4  技术路线

4. 试剂、材料计划清单

5. 实验动植物计划

6. 设备、器材