以5％敌敌畏丙酮液在每头昆虫的胸背板处点滴2/A(供试昆虫可用粘虫、棉铃虫、玉米螟等高龄幼虫或荔枝蝽象)，处理后约经30—60分钟，当昆虫中毒并接近死亡时，立即用小剪刀剪下20头昆虫头部盛于玻璃匀浆器内(预先吸入约3ml冰冷的磷酸盐缓冲液)，在低温条件下进行匀浆，以少量玻璃丝置于小型漏斗上把虫浆过滤，滤液用磷酸盐缓冲液定容至5ml，暂贮于冷冻室内备用。

另取20头正常(无药处理)昆虫头部，匀浆处理与上述药剂处理组相同。

4. 标准曲线的制作

取试管12支，分为6组(每组2支)，用吸管分别注入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.0ml的试剂②于各组已作标记试管中，并分别加入试剂①至试管中，使各管的溶液总量为1.5ml。然后将1—5组试管分别加入2ml试剂③加④混合液(按1 ：1比例临时混合)，用力摇动1分钟，加入lml试剂⑤摇匀，加入lml试剂⑥，摇匀后呈现深浅不同颜色。第6组试管在加入试剂①至总量达1.5ml后，先加入试剂⑤lml，摇匀后加入2ml试剂③加④混合液(按1：1比例临时混合)，摇匀后加lml试剂⑥，摇匀即成空白管。

5. 样本分析

取洁净干燥的试管9支，编号为1(1)、1(2)，(指正常B管)；2(1)、2(2) (指正常虫对照管)；3(1)、3(2)(药剂处理管)；4(1)、4(2)(药剂处理对照管)；5(空白管)。于各试管中加入lml试剂②、1与3管各加0.5ml正常虫和药剂处理后的虫浆，5号管则加入0.5ml磷酸盐缓冲液，摇匀后置于预先调好为37℃的恒温水浴摇床里40分钟。除空白管外，

表1 标准曲线操作步骤

其它各管应立即加入2ml试剂③加④混合液(按l：l比例临时混合)，用力摇动1分钟以上，2和4对照管分别加入正常虫和药剂处理虫的虫浆液各0.5ml。摇匀后加试剂⑤lml，摇匀后再加试剂⑥lml，摇匀后用滤纸过滤，空白管的制作同标准曲线中的空白管制作相同。其操作步骤也可见表1和2。

表2 样本制作步骤

6. 测定和结果整理

把标准或样本按制作步骤完成后，将滤液分别移至各比色杯中，用分光光度计在波长540μm下进行测定。以空白管调节光密度为“0”，分别测定标准或样本管并读出它们的光密度数值。

以不同浓度的乙酰胆碱量(微克分子浓度，/μM)数值做横坐标，各管测得的光密度数值做纵坐标即可绘制成一标准曲线。把测定样本的光密度值可从标准曲线坐标上求出样本的乙酰胆碱量。从而代入公式，求乙酰胆碱酯酶被抑制百分率(％)。例如，粘虫幼虫经敌敌畏处理后，其头部乙酰胆碱酯酶活性及其抑制百分率(％)，见表3。

表3 敌敌畏处理粘虫幼虫后乙酰胆碱酯酶活性及被抑制率(％)

受药后5龄粘虫幼虫（头部）乙酰胆碱酯酶被抑制率（%）：

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7. 习题

1. 按表18—1标准曲线制作方法绘制一标准曲线图，并按表18—3填写试验结果和作分析。

2. 采用酶化学法应特别注意哪些条件。